دانشکده علوم
بخش زیست شناسی
پایان نامه کارشناسی ارشد در رشتهی زیست شناسی جانوری(فیزیولوژی)
بررسی اثر عصاره هیدروالکلی برگ زیتون (Olea europea L.) بر روی قلب و عروق و تداخل اثر آن با سیستم های کولینرژیک و آدرنرژیک در موش صحرایی نر
به کوشش
مریم محمدیان
استاد راهنما
دکتر امین اله بهاءالدینی
شهریور ماه 1393

به نام خدا
اظهارنامه
اينجانب مریم محمدیان دانشجوي رشتهي زیست شناسی گرايش فیزیولوژی جانوری دانشكدهی علوم اظهارمي كنم كه اين پايان نامه حاصل پژوهش خودم بوده و در جاهايي كه از منابع ديگران استفاده كرده ام، نشاني دقيق و مشخصات كامل آن را نوشته ام. همچنين اظهارمي كنم كه تحقيق و موضوع پايان نامه ام تكراري نيست و تعهد مي نمايم كه بدون مجوز دانشگاه دستاوردهاي آن را منتشر ننموده و يا در اختيار غير قرار ندهم. كليه حقوق اين اثر مطابق با آيين نامه مالكيت فكري و معنوي متعلق به دانشگاه شيراز است.
نام ونام خانوادگي : مریم محمدیان
تاريخ و امضا: 30/06/1393
تقدیم به پدر و مادربزرگوارم
آنان که همیشه دوستشان دارم و صبوری و مهرشان تکیه گاه من است.

سپاسگزاری
سپاس خدایی را که اول همه آثار هستی است و پیش از او اولی نبوده و آخر است بی آن که پس از او آخری باشد. خدایی که دیده بینندگان از دیدنش قاصر و اندیشه وصف کنندگان از وصف او عاجز است.
اکنون که این رساله به پایان رسیده است، به رسم ادب و احترام بر خود واجب می دانم که سپاسگزار زحمات و حمایت های استاد راهنمای بزرگوارم جناب آقای دکترامین اله بهاءالدینی باشم که همچون پدری مهربان راهنمای من در مسیر رسیدن به موفقیت، خودباوری و استقلال بودند. خداوند را تا همیشه شاکر خواهم بود که افتخار آموختن از ایشان را نصیب من ساخت.
همچنین از اساتید مشاور ارجمندم، جناب آقای دکتر جعفر وطن پرست و جناب آقای دکتر احمدرضا خسروی به خاطر راهنمایی های ارزنده شان کمال تشکررا دارم. از استاد گرانقدر جناب آقای دکتر رضا یوسفی که زحمت داوری این رساله را برعهده گرفتند، بسیار سپاسگزارم. همچنین از حضور نماینده محترم تحصیلات تکمیلی جناب آقای دکتر حمیدرضا کربلایی حیدری تشکر می نمایم.
از پدر و مادر عزیز و بزرگوارم به پاس حمایت ها و محبت های بی دریغ شان و همه ی زحماتی که در تمام سال های تحصیلم متقبل شده اند، قدردانی می نمایم.
همچنین بر خود لازم می دانم تا از همراهی و کمک های صمیمانه دوست و همکار نازنینم سرکار خانم هاجر ابراهیمیان که طی این مدت همواره در کنار من بوده اند، کمال تشکر را داشته باشم.
در انتها از همهی دوستانم که به نوعی من را در انجام این پژوهش یاری نموده اند، سپاسگزارم.
چکیده
بررسی اثر عصاره هیدروالکلی برگ زیتون (Olea europea L.) بر روی قلب و عروق و تداخل اثر آن با سیستم های کولینرژیک و آدرنرژیک در موش صحرایی نر
به کوشش
مریم محمدیان
پرفشاری خون یکی از شایع ترین و مهم ترین بیماری های عصر حاضر است که اغلب در اثر سبک زندگی مدرن و به خصوص کاهش تحرک فیزیکی و دریافت رژیم غذایی پرچربی در افراد ایجاد می شود. یکی از مناسب ترین روش ها برای درمان این بیماری استفاده از گیاهان دارویی است که دارای اثر اصلاح کننده روی فشارخون هستند. از جمله این گیاهان می توان به زیتون (Olea europea L.) اشاره کرد. زیتون (Olea europea L.) در درمان بسیاری از بیماری ها مثل بیماری های قلبی- عروقی، آریتمی ها، آترواسکلروز و پرفشاری خون کاربرد دارد. برای تعیین برخی از اثرات برگ زیتون (Olea europea L.) بر روی فشارخون مطالعه حاضر با روش زیر انجام شد: 15 سر موش صحرایی نر از نژاد ویستار با محدوده ی وزنی 180-250 مورد استفاده قرار گرفتند. رت ها به وسیله تزریق داخل صفاقی یورتان (1.2g/kg) بیهوش شدند، بعد از تراکئوستومی، سیاهرگ و سرخرگ رانی حیوان به ترتیب برای تزریق دارو و اندازه گیری فشار خون و ضربان قلب کانول گذاری شدند. سپس کانول شریانی جهت ثبت فشار شریانی به ترنسدیوسر فشار مرتبط با دستگاه Power lab مجهز به سیستم A-to-D متصل شد. پارامترهای فشار خون (فشار میانگین سرخرگی، فشار سیستولی و فشار دیاستولی) و ضربان قلب قبل و بعد از تزریق درون وریدی عصاره آبی- الکلی برگ زیتون، حلال عصاره، استیل کولین و آدرنالین ثبت گردید. نتایج با استفاده از نرم افزار SPSS و با استفاده از تست One- Way ANOVA با در نظر گرفتن سطح معنی داری P≤0.05 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. برای مقایسه میانگین داده ها از تست LSD استفاده شد. نتایج نشان دهنده ی این است که تزریق درون وریدی عصاره برگ زیتون سبب کاهش فشار میانگین سرخرگی، فشار سیستولی، فشار دیاستولی و ضربان قلب در مقایسه با حالت شاهد و کنترل می شود. همچنین کاهش معنی دار فشارخون در حضور عصاره و آدرنالین و عصاره و استیل کولین در مقایسه با حالت کنترل مشاهده گردید. بنابراین می توان چنین نتیجه گیری کرد که عصاره آبی- الکلی برگ زیتون دارای اثر کاهندگی فشارخون است که به نظر می رسد این اثر ناشی از همسو عمل کردن با سیستم کولینرژیک و احتمالا مهار سیستم آدرنرژیک باشد.
واژگان کلیدی: برگ زیتون، ضربان قلب، فشار خون
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول…………………………………………………………………………………………………………………..1
1- مقدمه………………………………………………………………………………………………………………………………….2
1-1- زیتون………………………………………………………………………………………………………………………………3
1-2- ترکیبات فعال موجود در برگ زیتون…………………………………………………………………………….4
فصل دوم…………………………………………………………………………………………………………………..6
2- مروری بر تحقیقات پیشین…………………………………………………………………………………………………7
2-1- مطالعات انجام شده در رابطه با اثرات زیتون…………………………………………………………………7
2-2- هدف……………………………………………………………………………………………………………………………….8
عنوان صفحه
فصل سوم…………………………………………………………………………………………………………………9
3- مواد، وسائل و روش کار……………………………………………………………………………………………………….10
3-1- مواد………………………………………………………………………………………………………………………………….10
3-2- وسائل……………………………………………………………………………………………………………………………….11
3-3- تهیه و نگهداری موش صحرایی………………………………………………………………………………………13
3-4- عصاره گیری به روش ماسراسیون یا خیساندن………………………………………………………………13
3-5- اجزای سیستم ثبت فشار خون……………………………………………………………………………………….15
3-6- آماده سازی داروها…………………………………………………………………………………………………………..16
3-6-1- تهیه محلول استاک استیل کولین……………………………………………………………………………..16
3-6-2- تهیه محلول استاک آدرنالین………………………………………………………………………………………16
3-6-3- تهیه دوزهای مختلف عصاره برگ زیتون برای تزریق………………………………………………..17
3-7- مراحل انجام آزمایش……………………………………………………………………………………………………….17
3-7-1- بیهوش کردن حیوان…………………………………………………………………………………………………..17
3-7-2- آماده سازی جهت جراحی………………………………………………………………………………………….18
3-7-3- تراکئوستومی………………………………………………………………………………………………………………18
3-7-4- کانول گذاری سیاهرگ و سرخرگ رانی…………………………………………………………………….19
3-8- ثبت فشارخون وضربان قلب……………………………………………………………………………………………20
عنوان صفحه
3-8-1- آماده سازی جهت ثبت فشارخون و ضربان قلب……………………………………………………….20
3-8-2- کالیبراسیون ترانسدیوسر…………………………………………………………………………………………….20
3-9- چگونگی تجویز داروها……………………………………………………………………………………………………..21
3-10- تجزیه و تحلیل آماری…………………………………………………………………………………………………..23
3-11- بازه زمانی ذر نظر گرفته شده برای داده های هر گروه……………………………………………….23
فصل چهارم…………………………………………………………………………………………………………….24
1- نتایج…………………………………………………………………………………………………………………………………….25
4-1- گراف ثبت شده با دستگاه……………………………………………………………………………………………….25
4-2- فشار میانگین سرخرگی در پاسخ به دوزهای مختلف عصاره برگ زیتون در دو حالت کنترل و آزمایش………………………………………………………………………………………………………………………..26
4-3- فشار سیستولی،دیاستولی، فشار میانگین سرخرگی و ضربان قلب در حضور عصاره برگ زیتون………………………………………………………………………………………………………………………………………….27
4-4- فشار سیستولی،دیاستولی، فشار میانگین سرخرگی و ضربان قلب در حضور توام عصاره برگ زیتون و استیل کولین ……………………………………………………………………………………………………..29
4-5- فشار سیستولی،دیاستولی، فشار میانگین سرخرگی و ضربان قلب در حضور توام عصاره برگ زیتون و آدرنالین……………………………………………………………………………………………………………….31
فصل پنجم………………………………………………………………………………………………………………33
5- بحث و نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………………….34
عنوان صفحه
5-1- بررسی اثر عصاره آبی الکلی برگ زیتون فشارخون (فشار میانگین سرخرگی، فشار سیستول، فشار دیاستول و فشار نبض) و ضربان قلب………………………………………………………………34
5-2- تداخل اثر عصاره آبی الکلی برگ زیتون با سیستم کولینرژیک در سیستم قلب و عروق در موش صحرایی نر…………………………………………………………………………………………………………………..36
5-3- تداخل اثر عصاره آبی الکلی برگ زیتون با سیستم آدرنرژیک در سیستم قلب و عروق در موش صحرایی نر………………………………………………………………………………………………………………………..37
4-5- نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………………………….38
5-5- پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………………………38
فهرست منابع………………………………………………………………………………………………………….39
منابع فارسی……………………………………………………………………………………………………………………………….39
منابع انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………………………40
فهرست جدول ها
عنوان صفحه
جدول 4-1- تغییرات فشار سیستولی، دیاستولی، فشار میانگین سرخرگی و ضربان قلب در پاسخ به عصاره برگ زیتون و حلال عصاره ………………………………………………………………27
جدول 4-2- تغییرات فشار سیستولی، دیاستولی، فشار میانگین سرخرگی و ضربان قلب در پاسخ به استیل کولین و عصاره توام با استیل کولین ………………………………………………29
جدول 4-3- تغییرات فشار سیستولی، دیاستولی، فشار میانگین سرخرگی و ضربان قلب در پاسخ به آدرنالین و عصاره توام با آدرنالین………………………………………………………………..31
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل 1-1- زیتون……………………………………………………………………………………………………………………..3
شکل 3-1 اتاق حیوانات، دانشکده ی علوم، دانشگاه شیراز……………………………………………………..13
شکل 3-2 مراحل عصاره گیری………………………………………………………………………………………………..14
شکل 3-3 دستگاه پاور لب……………………………………………………………………………………………………….15
شکل 3-4 استیل کولین، آدرنالین……………………………………………………………………………………………17
شکل 3-5- تراکئوستومی………………………………………………………………………………………………………….18
شکل 3-6- سرخرگ و سیاهرگ رانی……………………………………………………………………………………..19
شکل3-7- اتصالات بین کانول سرخرگی، دام و ترانسدیوسر…………………………………………………20
دیاگرام1- گروه بندی و روند تزریقات…………………………………………………………………………………….22
شکل 4-1 گراف ثبت شده از فشار سیستولی، فشار دیاستولی، فشار میانگین سرخرگی و ضربان قلب (به ترتیب از بالا به پایین) در حالت پایه………………………………………………………………………….25
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار 4-1- مقایسه میزان افت فشارخون در پاسخ به دوزهای مختلف عصاره برگ زیتون در مقایسه با گروه کنترل……………………………………………………………………………………………………………….26
نمودار 4-2 – مقایسه فشار خون سیستولی، دیاستولی و فشار میانگین سرخرگی گروه های کنترل، حلال و دریافت کننده عصاره……………………………………………………………………………………….28
نمودار4-3- مقایسه ضربان قلب در گروه های کنترل، شاهد و عصاره برگ زیتون…………………28
نمودار 4-4- مقایسه فشار خون سیستولی، دیاستولی و فشار میانگین سرخرگی گروه های کنترل، دریافت کننده استیل کولین و عصاره برگ زیتون توام با استیل کولین……………………..30
نمودار 4-5- مقایسه ضربان قلب در گروه های کنترل، دریافت کننده استیل کولین و عصاره برگ زیتون توام با استیل کولین………………………………………………………………………………………………30
نمودار 4-6 – مقایسه فشار خون سیستولی، دیاستولی و فشار میانگین سرخرگی گروه های کنترل، دریافت کننده آدرنالین و عصاره برگ زیتون توام با آدرنالین……………………………………..32
نمودار 4-7- مقایسه ضربان قلب در گروه های کنترل، دریافت کننده آدرنالین و عصاره برگ زیتون توام با آدرنالین……………………………………………………………………………………………………………….32
فصل اول

1- مقدمه

پرفشاری خون یکی از شایع ترین و مهم ترین بیماری های عصر حاضر است که اغلب توسط سبک زندگی مدرن و به خصوص کاهش تحرک فیزیکی و دریافت رژیم غذایی پرچربی به افراد تحمیل می شود. این بیماری اغلب به صورت پنهان و بدون توجه آگاهانه رشد می کند و ممکن است در انتها منجر به ایجاد بیماری های قلبی- عروقی یا نارسایی قلبی حاد بشود. بنابراین پرفشاری خون باید کنترل شود و به دقت تحت درمان قرار بگیرد (Perrinjaquet-Moccetti, et al. 2008).
استفاده از اغلب داروهای ضد پرفشاری خون مثل β- بلاکرها، کلسیم بلاکرها، مهارکننده های آنزیم مبدل آنژیوتنسین1 و یا دیورتیک ها در دوزهای رایج، عوارض جانبی قابل توجهی در پی دارد. بنابراین به کار بردن روش های جایگزین از جمله استفاده از گیاهان دارویی که دارای اثر اصلاح کننده روی فشارخون باشند، می تواند مناسب باشد (Perrinjaquet-Moccetti, et al. 2008).
همزمان با پیدایش انسانها، استفاده از گیاهان دارویی نیز آغاز شد. با مطالعه در تمدن قدیمی به مصرف گیاهان دارویی به عنوان دارو، سم، مواد پاک کننده و رنگ، بر می خوریم. تاریخچه گیاهان دارویی به طور دقیق مشخص نیست و در طول تاریخ استفاده از گیاهان دارویی با خرافات و آداب خاصی همراه بوده است. مصری ها وچینی ها از اولین اقوامی هستند که از حدود 2700 سال پیش از میلاد مسیح از گیاهان به عنوان دارو استفاده می کردند. تئوفراست یکی از شاگردان ارسطو بنیانگذار مکتب درمان با گیاه است. دیوسکورید در قرن اول میلادی مجموعه ای را مشتمل بر خواص دارویی 600 گیاه جمع آوری نمود که این اثر منشا بسیاری از مطالعات در قرون بعد گردید. در قرن هشتم تا دهم میلادی بوعلی سینا و محمد زکریای رازی سبب توسعه دانش درمان با گیاه شدند. در قرن 18 و اوایل قرن 19 محققان پیشرفت قابل توجهی در خالص سازی و شناسایی ترکیبات شیمیایی موجود در گیاهان داشته و موادی را به صورت فرآورده های دارویی برای مصرف عرضه کردند اما در قرن نوزدهم داروهای شیمیایی به سرعت جایگزین بسیاری از داروهای گیاهی گردید. سپس در اواخر قرن بیستم عوارض جانبی و مضر داروهای شیمیایی سبب رویکرد دوباره دانشمندان به گیاهان دارویی شد. زیتون یکی از قدیمی ترین گیاهان دارویی با قدمتی معادل دو هزار سال است( ولاگ و استودولا، 1376 ؛ دگلو، 1363).

1-1- زیتون
طبقه بندی و جایگاه سیستماتیک زیتون:
سلسله: گیاهان (Plantae)
شاخه: گیاهان گلدار ((Magnoliophyta
رده: دولپه ای ها (Magnoliopsida)
راسته: نعناسانان (Lamiales)
تیره: زیتون (Oleaceae)
جنس: زیتون (Olea)
گونه: زیتون (Olea europaea) شکل 1-1 زیتون
جنس زيتون دارای 35 الی 40 گونه است كه معروفترين گونه آن، زيتون خوراكي با نام علمي Olea europaea است ( جایمند و همکاران.1385). زیتون یک درخت یا درختچه همیشه سبز با رشد آهسته است. این درخت بومی سواحل مدیترانه است که در سایر مناطق جهان نیز کشت می شود. محصولات این درخت از دیرباز به داشتن خواص درمانی و پزشکی شهرت داشته اند. معمولا روغن، میوه، پوست، صمغ و برگ درخت زیتون برای مصارف درمانی به کار می روند. زیتون در درمان بسیاری از بیماری ها مثل بیماری های قلبی- عروقی، آریتمی ها، آترواسکلروز، تب، اختلالات روده ای، هایپر کلسترولمی، دیابت و پرفشاری خون کاربرد دارد. برگ زیتون به طور خاص دارای ویژگی کاهندگی فشار خون است (Gilani, Khan. 2010).
نخستین اشاره به ویژگی درمانی برگ زیتون، در سال 1843 توسط Daniel Hanbury در انگلستان بود که گزارش داد در چای برگ زیتون یک ماده تلخ برای درمان تب مالاریا وجود دارد. در سال 1898 در آمریکا برگ زیتون به عنوان یک ماده برای کمک به تنظیم درجه حرارت بدن معرفی شد (Sada. 2009).
2-1- ترکیبات فعال موجود در برگ زیتون
ترکیبات اصلی برگ زیتون شامل خانواده Secoiridoids (اولئوروپئین و مشتقات آن)، هیدروکسی تیروزول، انواع پلی فنول ها (verbascoside, apigenin-7-glucoside, luteolin-7-glucoside)، تری ترپن ها (اولئانولیک اسید) و فلاونوئیدها (Rutin Diosmin,) است (Sada. 2009).
ماده فعال اصلی در برگ زیتون که مسئول بسیاری از خواص درمانی آن است، اولئوروپئین است که بعد از هیدرولیز می تواند مواد بیواکتیو دیگری مثل هیدروکسی تیروزول را بسازد(Al- Azzawie, Alhamdani. 2007). این ترکیب برای اولین بار در سال 1908 توسط Vintilesco و Bourquelot از برگ زیتون استخراج شد و ساختار شیمیایی آن در سال 1960 توسط Panizi مشخص شد. به نظرمی رسد اولئوروپئین عامل اصلی بسیاری از خواص درمانی برگ زیتون مثل کاهندگی فشار و قند خون باشد (Erbay, Icier. 2010).
اولئوروپئین در میوه نارس، میوه رسیده و برگ زیتون وجود دارد ولی مقدار آن در برگ زیتون به مراتب بیشتر از سایر قسمت ها است (Malik, Bradford. 2008).

فصل دوم

2- مروی بر تحقیقات پیشین

2-1- مطالعات انجام شده در رابطه با اثرات زیتون

اسماعیلی و همکاران در سال 1391 با به کاربردن عصاره خوراکی برگ زیتون روی رت نشان دادند که این ماده دارای اثرات آنتی آریتمیک است و این اثرات به مدت زمان تجویز آن وابسته است. به طوری که وقتی زمان تجویز به بیش از 14-7 روز افزایش می یابد، اثرات آنتی آریتمیک آن ظاهر می شود.
زاهری و همکاران در سال 1390 با به کاربردن عصاره آبی- الکلی برگ زیتون گرمسیری روی عروق رت دیابتی نشان دادند که این عصاره می تواند علاوه بر کاهش قند خون، حساسیت عروق دیابتی را به فنیل افرین کاهش دهد و کسر کلسیم بر منیزیم که معیاری برای آترواسکلروز است را بهبود بخشد.
Nekooeian و همکاران در سال 2011 با به کار بردن عصاره هیدروالکلی زیتون روی فشار خون در رت هایی که پر فشاری خون در آن ها با روش One-Clip Goldblatt القا شده بود، نشان دادند که این عصاره از افزایش فشار متوسط شریانی جلوگیری می کند.
Abe و همکاران در سال 2011 نشان دادند که به کاربردن اولئوروپئین در محیط کشت سلول های عضله صاف، از رشد این سلول ها از طریق توقف چرخه سلولی جلوگیری می کند و به این ترتیب میتواند روی مرگ و میرهای ناشی از بیماری های قلبی عروقی اثرات مفیدی داشته باشد.
Rodrı´guez و همکاران در سال 2004 نشان دادند که به کاربردن دو ترکیب oleanolic acid و erythrodiol روی آئورت توراسیک ایزوله شده موش صحرایی، باعث ایجاد اثرات گشاد کنندگی در رگ می شود.
De la Puerta و همکاران در سال 2001 گزارش دادند که اولئوروپئین می تواند بیان آنزیم نیتریک اکساید سنتاز القایی (iNOS) را در سلول افزایش دهد.
Wangو همکاران در سال 2008 گزارش دادند که مصرف عصاره برگ زیتون در رژیم غذایی خرگوش ها از ایجاد آترواسکلروز جلوگیری می کند.

2-2- هدف
با توجه به مطالعات صورت گرفته در زمینه اثر عصاره برگ زیتون بر فشار خون و گزارش های محدود مبنی بر مکانیسم اثر این عصاره در این زمینه، در تحقیق حاضر اثر عصاره برگ زیتون بر روی فشار خون موش صحرایی و بررسی مکانیسم اثر احتمالی آن از مسیرهای کولینرژیک و آدرنرژیک مد نظر است.

فصل سوم
3- مواد، وسایل و روش کار
3-1- مواد
– موش صحرایی نر بالغ نژاد ویستار
– غذای موش (خریداری شده از شرکت جوانه خراسان)
– عصاره آبی الکلی برگ زیتون
– یورتان (Sigma, USA)
– استیل کولین (England)
– آدرنالین (Merck آلمان)
– آتروپین (Sigma)
– هپارین
– الکل (شرکت کیمیا الکل زنجان)
– سدیم کلراید (Merck آلمان)
– پتاسیم کلراید (Merck آلمان)
– سرم قندی نمکی (دکستروز ۳٫۳% و سدیم کلراید ۰٫۳%)
– آب مقطر
– کپسول اکسیژن
– نخ جراحی
– پنبه
– گاز استریل
3-2- وسایل
– دستگاه Power lab مجهز به Bridge amplifier، Recorder و Transducer )ساخت کشور Australia)
– قفس نگهداری حیوان
– وسایل تشریح (قیچی، پنس در اندازه های مختلف، پنس هموستات استریت، قیچی رگ بر، سینی تشریح )
– ماشین ریش تراش(MOSER, Germany)
– میز جراحی
– استریو میکروسکوپ
– دماسنج رکتال
– سمپلر
– سرسمپلر
– ترازو
– اپندورف
– یخچال
– کامپیوتر
– سرنگ ( انسولین، شماره 2 و شماره 5)
– فشار سنج جیوه ای
– کانول
– پیپت و پیپتور
– بشر
– قیف
– کاغذ صافی
– پارافیلم
– پتری دیش
– ورتکس
– ویال
– آسیاب برقی
– انکوباتور
3-3- تهیه و نگهداری موش صحرایی
تعداد 15 سر موش صحرایی نر بالغ از نژاد ویستار با محدوده ی وزنی بین250-180 گرم از مرکز پرورش حیوانات موسسه سرم سازی رازی شیراز تهیه و به اتاق حیوانات بخش زیست شناسی دانشکده علوم منتقل گردید (شکل3-1). موش ها به مدت یک هفته در شرایط کنترل شده نور (12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی) و حرارت 3±22 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. در طول مدت نگهداری حیوانات به آب و غذای کافی دسترسی داشتند.

شکل 3-1 اتاق حیوانات، دانشکده ی علوم، دانشگاه شیراز
3-4- عصاره گیری به روش ماسراسیون یا خیساندن
در ابتدا برگ های درخت زیتون جمع آوری شد و توسط استاد گیاه شناسی دانشکده علوم شیراز مورد شناسایی علمی قرار گرفت. از گیاه مورد نظر نمونه سند تهیه شد که این نمونه با شماره 25051 در هرباریوم دانشگاه شیراز نگهداری می شود. سپس برگ ها شسته و در شرایط استاندارد سایه و دمای 28-26 درجه سانتی گراد خشک و به وسیله آسیاب برقی پودر شد و برای تهیه عصاره به بشر 1800 میلی لیتری منتقل شد. سپس به آن به میزان کافی اتانول 70% اضافه شد تا فضاهای بین پودر برگ پر بشود و حلال به طور کامل روی پودر را بگیرد. روی ظرف با پارافیلم پوشانده شد و به مدت 24 ساعت در همین شرایط ثابت ماند. در طول این مدت در صورت پایین آمدن سطح حلال مجددا به آن حلال اضافه شد. پس از گذشت 24 ساعت محلول روی سطح پودر با کاغذ صافی و قیف صاف و به پتریدیش ها منتقل شد و به مدت 72 ساعت در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی گراد قرار داده شد تا کاملا خشک شده و به حالت پودر تبدیل گردد (شکل 3-2).

شکل 3-2- مراحل عصاره گیری
3-5- اجزای سیستم ثبت فشار خون
در این پژوهش برای ثبت فشار خون و ضربان قلب از دستگاه پاور لب ( ساخت کشور استرالیا) استفاده شد. پاور لب به مجموعه ای از دستگاه ها و نرم افزار گفته می شود که برای ثبت، نمایش و آنالیز داده های آزمایشگاهی طراحی و ساخته شده است. سخت افزار پاور لب شامل Recorder، Bridge amplifier، Bio amplifier و Transducer می باشد. نرم افزار این سیستم Lab Chart است. در این سیستم سیگنال ورودی که ولتاژ آنالوگ (پیوسته در زمان) می باشد وارد نرم افزار پاور لب شده و عملیات فیلتر کردن، تقویت و نمونه برداری روی سیگنال آنالوگ انجام شده و سیگنال دیجیتالی خروجی روی کامپیوتر نمایش داده می شود (شکل 3-3).

شکل 3-3 دستگاه پاور لب
3-6- آماده سازی دوزهای داروها

دارو های مورد استفاده در این آزمایش استیل کولین، آدرنالین، آتروپین، عصاره آبی الکلی برگ زیتون بودند. دوزهای هر دارو قبل از استفاده با توجه به میزان میلی گرم مصرف دارو در هر کیلوگرم (mg/kg) تعیین می گردید و از هر دارو استاک لازم تهیه شده در دما و شرایط مطلوب نگهداری می شدند (شکل3-4). حجم تزریق همه داروها 300 میکرولیتر بود.

3-6-1- تهیه محلول استاک استیل کولین

برای این منظور مقدار یک میلی گرم استیل کولین توسط ترازوی حساس کشیده و سپس در ml5 سرم فیزیولوژی حل شد درب ظرف با پارافیلم پوشانده شد و جهت نرسیدن نور به دارو دور ظرف با کاغذ آلومینیومی پوشانده و دارو در یخچال نگهداری شد. از این محلول بعدا جهت تهیه دوز های مختلف استفاده شد.

3-6-2- تهیه محلول استاک آدرنالین

برای این منظور مقدار یک میلی گرم آدرنالین توسط ترازوی حساس کشیده و سپس در ml5/2 سرم فیزیولوژی حل شد درب ظرف با پارافیلم پوشانده شد و جهت نرسیدن نور به دارو دور ظرف با کاغذ آلومینیومی پوشانده و دارو در یخچال نگهداری شد. از این محلول بعدا جهت تهیه دوز های مختلف استفاده شد.
شکل 3-4 به ترتیب از راست به چپ: استیل کولین، آدرنالین
3-6-3- تهیه دوز های مختلف عصاره برگ زیتون برای تزریق

برای این منظور ابتدا دوز لازم برای هر موش با توجه به وزن آن محاسبه می گردید. سپس مقدار محاسبه شده توسط ترازو کشیده، بعد به آن 300 میکرولیتر حلال اضافه و روی دستگاه ورتکس حل می شد.

3-7- مراحل انجام آزمایش

3-7-1- بیهوش کردن حیوان

در شروع آزمایش، حیوان با تزریق داخل صفاقی g/kg 2/1 یورتان بی هوش می گردید.
3-7-2- آماده سازی جهت جراحی

پس از اطمینان از بیهوشی حیوان، موی نواحی کشاله ران و گردن توسط ماشین ریش تراش تراشیده و تمیز می گردید. سپس حیوان روی سینی تشریح بر روی میز جراحی فیکس می شد.

3-7-3- تراکئوستومی

برای جلوگیری از خفگی در زمان بیهوشی، تراکئوستومی انجام شد. برای این منظور بعد از ایجاد برش کوچکی روی پوست گردن و کنار زدن فاشیا و عضله توسط پنس کلمپ و نمایان شدن نای، روی نای توسط قیچی برش کوچکی زده شد و کانول گذاری انجام شد( شکل 3-5).

شکل 3-5 تراکئوستومی
3-7-4- کانول گذاری ورید و شریان رانی

با برش پوست در ناحیه کشاله ران توسط قیچی و کنار زدن فاشیا و عضله توسط پنس کلمپ، عروق و عصب همراه آن نمایان شد. رگ ها و عصب همراه آنها زیر میکروسکوپ توسط پنس های ظریفی از هم جدا شدند. شریان و ورید در بخش منتهی به اندام تحتانی توسط نخ کاملا مسدود و در قسمت شکمی توسط نخ و پنس کلمپ به طور موقت جهت جلوگیری از خون ریزی بعد از برش زدن، مسدود شدند. سپس برش کوچکی روی رگ توسط قیچی مخصوص ایجاد می شد و عروق توسط کانول هپارینه شده، کانول گذاری می شدند. جهت اطمینان از ثابت ماندن کانول در رگ، کانول با نخ روی رگ فیکس می شد (شکل 3-6).
از کانول سیاهرگی برای تزریق داروها استفاده می شد و کانول سرخرگی برای ثبت فشارخون از طریق ترانسدیوسر فشار متصل به دستگاه پاور لب استفاده می شد.

شکل 3-6 سرخرگ و سیاهرگ رانی
3-8- ثبت فشار خون و ضربان قلب

3-8-1- آماده سازی جهت ثبت فشار خون و ضربان قلب

برای اندازه گیری فشار متوسط شریان، فشار سیستول، فشار دیاستول و ضربان قلب کانول شریانی به دام متصل می شد و دام روی ترانسدیوسر نصب می گردید (شکل3-7).
شکل3-7 اتصالات بین کانول سرخرگی، دام و ترانسدیوسر
3-8-2- کالیبراسیون ترانسدیوسر

قبل از ثبت فشار خون، کالیبراسیون ترانسدیوسر از طریق کالیبراسیون دو نقطه ای انجام می شد. برای این منظور ابتدا با استفاده از نرم افزار Lab chart، Bridge amplifier صفر می شد سپس به کمک فشار سنج جیوه ای متصل شده به دام و ترانسدیوسر دو فشار صفر و صد ایجاد می شد. سپس در نرم افزار Lab chart، گزینه unit conversion انتخاب و فشار صفر و صد میلی متر جیوه بر حسب میلی ولت برای دستگاه تعریف می شد.
3-9- چگونگی تجویز داروها

پس از اتمام جراحی، یک ساعت به حیوان استراحت داده می شد تا عوارض ناشی از استرس جراحی برطرف شده و حیوان در وضعیتی پایدار قرار گیرد. سپس فشار خون حیوان ثبت می شد. رت ها به طور تصادفی به سه گروه (هرگروه شامل 5 موش صحرایی نر بالغ) تقسیم شدند:
1) گروه دریافت کننده عصاره برگ زیتون
در ابتدا فشار خون حیوانات در این گروه بدون دریافت هیچ گونه تیماری به مدت 30 دقیقه ثبت شد سپس 300 میکرولیتر حلال عصاره از طریق کانول وریدی طی 15 ثانیه تزریق شد و فشار خون ثبت شد پس از برگشت فشار خون به حالت نرمال، 300 میکرولیتر عصاره برگ زیتون (معادل 160 میلی گرم بر کیلوگرم) مشابه قبل تزریق شد و فشار خون ثبت گردید.

2) گروه دریافت کننده عصاره برگ زیتون و استیل کولین
در ابتدا فشار خون حیوانات در این گروه بدون دریافت هیچ گونه تیماری به مدت 30 دقیقه ثبت شد سپس 300 میکرولیتر حلال استیل کولین (سرم فیزیولوژیک) از طریق کانول وریدی طی 15 ثانیه تزریق و فشار خون ثبت شد پس از برگشت فشار خون به حالت نرمال، 300 میکرولیتر استیل کولین (معادل 01/0میلی گرم بر گیلوگرم) مشابه قبل تزریق و فشار خون ثبت گردید مجددا پس از برگشت فشار خون به حالت نرمال عصاره و استیل کولین پشت سر هم تزریق شدند وفشار خون در این حالت ثبت شد.

3) گروه دریافت کننده عصاره برگ زیتون و آدرنالین
در ابتدا فشار خون حیوانات در این گروه بدون دریافت هیچ گونه تیماری به مدت 30 دقیقه ثبت شد سپس 300 میکرولیتر حلال آدرنالین (سرم فیزیولوژیک) از طریق کانول وریدی طی 15 ثانیه تزریق و فشار خون ثبت شد پس از برگشت فشار خون به حالت نرمال، 300 میکرولیتر آدرنالین (معادل 04/ میلی گرم بر کیلوگرم) مشابه قبل تزریق و فشار خون ثبت گردید مجددا پس از برگشت فشار خون به حالت نرمال عصاره و آدرنالین پشت سر هم تزریق شدند و فشار خون در این حالت ثبت شد.
در همه گروه های بالا، 30 دقیقه ابتدای ثبت که طی آن فشار نرمال ثبت می گردید به عنوان حالت کنترل و همچنین ثبت های پس از تزریق حلال عصاره و حلال داروها به عنوان گروه حالت در نظر گرفته شد
چگونگی گروه بندی و روند تزریقات در دیاگرام 1 نمایش داده شده است
دیاگرام1- گروه بندی و روند تزریقات
3-10- تجزیه و تحلیل آماری

گراف های ثبت شده با استفاده از نرم افزار Lab chart متعلق به سیستم پاورلب
به اعداد تبدیل شد و این اعداد به وسیله نرم افزار SPSS و با استفاده از تست One- Way ANOVA با در نظر گرفتن سطح معنی داری P≤0.05 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. برای مقایسه میانگین داده ها از تست LSD استفاده شد. ترسیم نمودار با استفاده از نرم افزار Microsoft Excel 2010 انجام شد.

بازه زمانی در نظر گرفته شده برای داده های هر گروه

میانگین داده های 5 دقیقه قبل از تزریق داروها و حلال آن ها به عنوان ثبت کنترل در نظر گرفته شد.
میانگین داده های 5 دقیقه اول بعد از تزریق حلال عصاره و حلال داروها به عنوان ثبت شاهد در نظر گرفته شد.
میانگین داده های 5 دقیقه اول بعد از تزریق عصاره به عنوان ثبت عصاره در نظر گرفته شد.
میانگین داده های 30 ثانیه اول بعد از تزریق استیل کولین به عنوان ثبت استیل کولین در نظر گرفته شد.
میانگین داده های 30 ثانیه اول بعد از تزریق توام عصاره و استیل کولین به عنوان ثبت تزریق توام عصاره و استیل کولین در نظر گرفته شد.
میانگین داده های 1 دقیقه اول بعد از تزریق آدرنالین به عنوان ثبت آدرنالین در نظر گرفته شد.
میانگین داده های 1 دقیقه اول بعد از تزریق توام عصاره و آدرنالین به عنوان ثبت توام عصاره و آدرنالین در نظر گرفته شد.
فصل چهارم
4- نتایج
4-1- گراف ثبت شده با دستگاه

شکل 4-1 گراف ثبت شده از فشار سیستولی، فشار دیاستولی، فشار میانگین سرخرگی و ضربان قلب (به ترتیب از بالا به پایین) در حالت پایه
4-2- فشار میانگین سرخرگی در پاسخ به دوزهای مختلف عصاره برگ زیتون در دو حالت کنترل و آزمایش

همان طور که در نمودار 4-1 مشاهده می شود در بین دوزهای مختلف تست شده ، سریع ترین و طولانی ترین افت فشار میانگین سرخرگی در پاسخ به عصاره با دوز 160 میلی گرم بر کیلوگرم اتفاق افتاده است.

نمودار 4-1- مقایسه میزان تغییرات فشارخون در پاسخ به دوزهای مختلف عصاره برگ زیتون در مقایسه با گروه کنترل

4-3- فشار سیستولی، دیاستولی، فشارمیانگین سرخرگی و ضربان قلب در حضور عصاره برگ زیتون
با توجه به جدول 4-1 فشار سیستولی، دیاستولی، فشارمیانگین سرخرگی و ضربان قلب در پاسخ به عصاره برگ زیتون در مقایسه با گروه شاهد (اتانول 70%) و گروه کنترل کاهش معنی دار پیدا کرد.
جدول 4-1- تغییرات فشار سیستولی، دیاستولی، فشار میانگین سرخرگی (mmHg) و ضربان قلب (Beat/min) در پاسخ به عصاره برگ زیتون و حلال عصاره
a نشان دهنده اختلاف معنی دار گروه آزمایش در مقایسه با گروه شاهد و کنترل P=0.000
c نشان دهنده اختلاف معنی دار گروه آزمایش در مقایسه با گروه شاهد P=0.008
d نشان دهنده اختلاف معنی دار گروه آزمایش در مقایسه با گروه کنترل P=0.009
e نشان دهنده عدم اختلاف معنی دار بین گروه شاهد و کنترل P≤0.05
پارامترها
گروه N=5 فشار سیستولی فشار دیاستولی فشار میانگین سرخرگیضربان قلب کنترل2924/119
74/3±5641/74
32/6±4571/89
94/4±3979/428
44/25±شاهد (حلال عصاره)5348/122 e
06/6±8006/88 e
76/4±0454/100 e
77/3±4505/431 e
06/24±آزمایش (عصاره)7754/61 a
55/4±9706/36 a
30/4±2388/45 a
29/4±2031/314c,d
01/28±
نمودار 4-2 – مقایسه فشار خون سیستولی، دیاستولی و فشار میانگین سرخرگی گروه های کنترل، حلال و دریافت کننده عصاره
a نشان دهنده اختلاف معنادار گروه دریافت کننده عصاره نسبت به گروه شاهد و کنترل P=0.000
e نشان دهنده عدم اختلاف معنا دار بین گروه شاهد و کنترل P≤0.05
نمودار4-3- مقایسه ضربان قلب در گروه های کنترل، شاهد و عصاره برگ زیتون
cنشان دهنده اختلاف معنا دار گروه آزمایش در مقایسه با گروه شاهد P=0.008
d نشان دهنده اختلاف معنا دار گروه آزمایش در مقایسه با گروه کنترل P=0.009
e نشان دهنده عدم اختلاف معنی دار بین گروه شاهد و کنترل P≤0.0
4-4- فشار سیستولی، دیاستولی، فشارمیانگین سرخرگی و ضربان قلب در حضور توام عصاره برگ زیتون و استیل کولین
با توجه به جدول 4-2 فشار سیستولی، دیاستولی، فشارمیانگین سرخرگی و ضربان قلب در پاسخ به استیل کولین و عصاره توام با استیل کولین به نسبت گروه کنترل کاهش یافت.
جدول 4-2- تغییرات فشار سیستولی، دیاستولی، فشار میانگین سرخرگی (mmHg) و ضربان قلب (Beat/min) در پاسخ به استیل کولین و عصاره توام با استیل کولین
a نشان دهنده اختلاف معنا دار گروه آزمایش و شاهد در مقایسه با گروه کنترل P=0.000
b نشان دهنده اختلاف معنادار گروه آزمایش در مقایسه با گروه شاهد P=0.001
c نشان دهنده اختلاف معنادار گروه آزمایش در مقایسه با گروه شاهد P=0.041
d نشان دهنده اختلاف معنادار گروه آزمایش در مقایسه با گروه کنترل P=0.020
e نشان دهنده اختلاف معنادار گروه آزمایش در مقایسه با گروه شاهد P=0.050
f نشان دهنده عدم اختلاف معنادار گروه شاهد در مقایسه با گروه کنترل P≤0.05
پارامترها
گروه N=5 فشار سیستولی فشار دیاستولی فشار میانگین سرخرگیضربان قلب کنترل6315/118
19/3±0848/84
77/3±6003/95
90/2±2978/444
92/20±شاهد (استیل کولین)1561/69a
07/2±2761/46 a
97/2±9027/53 a
59/2±4857/428f
24/23±آزمایش (استیل کولین و عصاره)6184/52 a, b
48/2±9976/42 a
88/0±2046 /46 a, c
32/1±2494/359d,e
37/13±
نمودار 4-4- مقایسه فشار خون سیستولی، دیاستولی و فشار میانگین سرخرگی گروه های کنترل، دریافت کننده استیل کولین و عصاره برگ زیتون توام با استیل کولین
a نشان دهنده اختلاف معنا دار گروه آزمایش و شاهد در مقایسه با گروه کنترل P=0.000
b نشان دهنده اختلاف معنادار گروه آزمایش در مقایسه با گروه شاهد P=0.001
c نشان دهنده اختلاف معنادار گروه آزمایش در مقایسه با گروه کنترل P=0.049
نمودار 4-5- مقایسه ضربان قلب در گروه های کنترل، دریافت کننده استیل کولین و عصاره برگ زیتون توام با استیل کولین
d نشان دهنده اختلاف معنادار گروه آزمایش در مقایسه با گروه کنترل P=0.020
e نشان دهنده اختلاف معنادار گروه آزمایش در مقایسه با گروه شاهد P=0.050
f نشان دهنده عدم اختلاف معنادار گروه شاهد در مقایسه با گروه کنترل P≤0.05
4-5- فشار سیستولی، دیاستولی، فشارمیانگین سرخرگی و ضربان قلب در حضور توام عصاره برگ زیتون و آدرنالین
با توجه به جدول 4-3 فشار سیستولی، دیاستولی و فشارمیانگین سرخرگی در پاسخ به آدرنالین به نسبت گروه کنترل افزایش داشت .این پارامترها در گروه آدرنالین توام با عصاره به نسبت گروه آدرنالین کاهش نشان دادند. ضربان قلب در گروه آدرنالین و آدرنالین توام با عصاره به نسبت گروه کنترل کاهش یافت.
جدول 4-3- تغییرات فشار سیستولی، دیاستولی، فشار میانگین سرخرگی (mmHg) و ضربان قلب (Beat/min) در پاسخ به آدرنالین و عصاره توام با آدرنالین
a نشان دهنده اختلاف معنادار



قیمت: تومان

دسته بندی : پایان نامه

پاسخ دهید