دانشکده شیمی
پایان نامهی دوره کارشناسی ارشد در رشته شیمی تجزیه
موضوع:
اصلاح الکترود خمیرکربن با نانو ذرات SiO2 و کاربرد آن به عنوان زیست حسگر الکتروشیمیایی در بررسی برهمکنش ساختار DNA-i-motif با تاموکسیفن و اندازهگیری الکتروشیمیایی آن
استاد راهنما:
دکتر جهانبخش رئوف
استاد مشاور:
دکتر رضا اوجانی
نام دانشجو:
الهام حیدری
بهمن 1393
تقدیر وتشکر
خدای مهربان را شاکرم که هرنفسم و هر قدمم به لطف و عنایت اوست هرچه داد از کرمش و هر چه نداد از حکمتش بود.چه زیباست ستایش خالق، در حالی که تقدیر از مخلوق ، جنبه ای از ستایش خالق است.شکل گیری و به بار نشستن این تحقیق مدیون راهنماییهای استاد ارجمندم جناب آقای دکتر جهانبخش رئوف میباشد که در تمامی مراحل راه را برمن ، هموار نمودند و علم خود را بیدریغ در اختیارم نهادند. از ایشان به خاطر زحماتی که در این مدت متحمل گردیدند صمیمانه سپاسگذارم.
همچنین از جناب آقای دکتر رضا اوجانی استاد مشاور گرامی که در طی انجام این تحقیق مرا یاری دادند قدردانی میکنم.
برخودلازم میدانم از اساتید بزرگوار جناب آقای دکتر حاج محمدی و دکتر عزیزی که داوری این پایان نامه را بر عهده داشتند، تشکرنمایم.
تقدیم به
پدر و مادر عزیزم
گوهرهایی بی همتا
در بحر بی دریغ فداکاریها که وجودشان برایم همه عشق است و وجودم برایشان همه رنج
چکیده
تلومرها كمپلكسهايي متشكل از DNA و پروتئين ميباشند كه نقش مهمي را در جهشهاي ژني و ايجاد سرطان دارند. آنزيم تلومراز، طول كروموزوم را از طريق سنتز تلومرها افزايش داده و در حدود 85% از سرطانها فعال است. در انتهاي تلومرها يك دو رشتهاي DNA با توالي (5-TTAGGG):(5-CCCTAA) وجود دارد. رشته غني از سيتوزين قادر است ساختار i-motif DNA را تشكيل دهد. مطالعات نشان داده است كه با پايدار كردن اين ساختار ميتوان از تشكيل ساختار دو رشتهاي و در نتيجه طويل شدن طول تلومرها جلوگيري كرد. داروي تاموكسيفن یک عامل هورمونی ضد استروژن برای درمان سرطان سینه ميباشد كه براي مدت زيادي به منظور درمان سرطان سينه به كار ميرود. در این تحقیق در مرحله اول امکان اندازهگیری الکتروشیمیایی داروی تاموکسیفن سیترات در سطح الکترود خمیر کربن اصلاح شده با نانو ذرات 2SiO به کمک ولتامتری پالس تفاضلی و ولتامتری چرخهای مورد مطالعه قرار گرفت و سنجش مقدار تاموکسیفن در نمونه حقیقی به کمک روش افزایش استاندارد صورت پذیرفت. در مرحله دوم، با طراحی زیست حسگرهایی بر مبنای ساختار i-motif، برهمکنش اين ساختار با داروی ضد سرطان تاموکسیفن سیترات، مورد بررسی قرار گرفت. زیستحسگر الکتروشیمیایی از طريق اصلاح الکترود خمیر کربن (CPE) با نانوذرات 2 SiOو –L سیستئین سپس تثبيت ساختار i-motif DNA بر روي سطح تهيه شد و برای بررسی برهمكنش اين ساختار با داروي تاموكسيفن به كار گرفته شد. پایداری ساختار i-motif ، یک استراتژی خوب برای درمان سرطان است، چون میتواند از واکنش تلومراز در سلول سرطانی جلوگیری کند. برهمکنش بینi-motif DNAو دارو تاموکسیفن، در بافر فسفات M 1/0(PBS) و محلول3[Fe (CN)6]- از طریق ولتامتری چرخهای (CV) و روش ولتامتری موج مربعی (SWV) مورد مطالعه قرار گرفت. دماغه اکسایشی تاموکسیفن بعد از تثبیتDNA i-motif روی سطح الکترود به دلیل برهمکنشDNA i-motif و تاموکسیفن مشاهده شد و با افزایش غلظت داروی تاموکسیفن، سیگنال افزایش مییابد. از روش طیفبینی دورنگ نمایی دورانی (CD) برای بدست آوردن اطلاعاتی در مورد نحوه شکلگیری ساختار و برهمکنش لیگاند با این ساختار مورد بررسی قرار گرفت و نتایج نشان داد که این ساختار در pH حدود 5/4 ساخته شده، ولی پایداری آن با افزایشpH محیط کاهش مییابد. حد تشخیص کاوشگر تثبیت شده بر سطح الکترود خمیر کربن اصلاح شده بر مبنای سه برابر انحراف استاندارد برابرm μ 06/0 تعیین شد.
واژگان کلیدی: زیست حسگر الکتروشیمیایی DNA ، تاموکسیفن، سلولهای سرطانی، ساختار i-motif DNA
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول: مقدمه
مقدمه2
فصل دوم: تئوری
2-1- الکترودهای اصلاح شده شیمیایی11
2-2- حسگرها13
2-3- حسگرهای الکتروشیمیایی13
2-4- زیست حسگرها15
2-5- زیست حسگرهای الکتروشیمیایی DNA16
2-6- ساختار مولکول DNA18
2-6-1- DNA سه رشتهای23
2-6-2- DNA چهار رشتهای24
2-6-2-الف- G-DNA24
2-6-2- ب- i-motif25
2-7- کاوشگرها و تثبیت آنها بر سطح مبدل26
2-7-1- تثبیت DNA کاوشگر از طریق جذب سطحی26
2-7-1-1 جذب سطحی فیزیکی27
2-7-1-2- جذب سطحی در پتانسیل کنترل شده27
2-7-1-3-تثبیت DNA بوسیله اتصال کوالانسی27
2-8- انواع برهمکنش میان نشانگرها و DNA28
2-8-1- برهمکنش الکترواستاتیک28
عنوان صفحه
2-8-2- برهمکنش درون رشتهای28
2-8-3- برهمکنش با شیار28
2-9- تلومر29
2-10- آنزیم تلومراز29
فصل سوم: بخش تجربی
3-1-مواد شیمیایی مورد نیاز32
3-2-وسایل و تجهیزات34
3-3- الکترودهای مورد استفاده35
3-4-تهیه الکترودهای کار35
3-4-1- تهیهی الکترود خمیر کربن برهنه (CPE)35
3-4-2- تهیه الکترود خمیر کربن اصلاح شده با نانوذرات 2 SiO و –L سیستئین / L -Cys) 2NSiO)36
3-5- بافرهای مورد استفاده برای تثبیت pH 37
3-6- تهیه محلولها38
3-7- مشخصهیابی سطح الکترود38
فصل چهارم: اصلاح الکترود خمیر کربن با نانو ذرات 2 SiO و کاربرد آن برای تعیین الکتروشیمایی داروی تاموکسیفن سیترات
4-1- مطالعه ولتامتری چرخهای الکترودهای کار41
4-2- مطالعه اسپکتروسکوپی امپدانس الکتروشیمیایی42
4 -3- اثر pH محلول بافر به رفتار الکتروشیمیایی تاموکسیفن سیترات در سطح /CPE 2SiO 44
4-4- بررسی رفتار الکتروشیمیایی محلول تاموکسیفن سیترات در سطح الکترودهای خمیر کربن اصلاح شده با نانو ذرات
عنوان صفحه
2 SiO………………………………………………………………………….45
4-5- اثر سرعت روبش پتانسیل بر رفتار الکتروشیمیایی تاموکسیفن سیترات در سطح /CPE 2SiO 46
4-6- تعیین محدوده خطی غلظتی تاموکسیفن سیترات و حد تشخیص روش48
4-7- اندازهگیری تاموکسیفن سیترات در نمونه حقیقی به کمک روش پیشنهادی50
فصل پنجم: اصلاح الکترود خمیر کربن با نانو ذرات /L-Cys 2 SiO و کاربرد آن به عنوان زیست حسگر الکتروشیمیایی در بررسی برهمکنش ساختار DNA-i-motif باتاموکسیفن
5-1- کلیات53
5-2- اهمیت ساختار i-motif DNA53
5-3- ویژگیهای CPE/2NSiO / i-Motif DNA56
5-3-2- مطالعه ولتامتری چرخهای چگونگی تثبیت DNA بر روی سطح الکترود اصلاح شده58
5-4 –مطالعه رفتار الکتروشیمیایی تاموکسیفن در سطح زیست حسگر الکتروشیمیایی59
5-4-1- ولتامتری چرخهای59
5-4-2- ولتامتری موج مربعی61
5-5 – اثر pH بر رفتار الکتروشیمیایی تاموکسیفن در سطح63
5-6- بررسی طیف سنجی CD65
5-7- نتیجهگیری 67
نتیجهگیری نهایی68
پیشنهادات برای کارهای آینده69
مراجع70
چکیده انگلیسی
فهرست شکلها
عنوان صفحه
شکل 2-1- ساختار یک حسگر الکتروشیمیایی نوعی15
شکل 2-2- مراحل تشخیص DNA17
شکل 2-3- شمايي از يك كروموزوم و زنجير دورشتهاي DNA موجود در داخل كروموزوم و همچنين بازشدة قسمتي از DNA با نشان دادن پیوند فسفودی استر بین دو قند پنتوز و همچنین پیوند هیدروژنی بین بازهای آلی در ساختار دورشته‌اي) parsianshiraz.blogspot.com) DNA.21
شکل2-4- ساختارهای متفاوت DNA 22
شکل2-5- ساختار چهار رشتهای G-quderplux25
شکل2-6- ساختار چهار رشتهای i-motif DNA-26
شکل 3-1-الف) فرمول ساختاری و برخی از ویژگیهای تاموکسیفن سیترات و ب) ساختار L- سیستئین33
شکل ۳-2- (الف) دستگاه پتانسیواستات / گالوانواستات اتولب و (ب) سل آزمایشگاهی35
شکل3- 3- نمایش نموداری از تهیه الکترود خمیر کربن اصلاح شده37
شکل4-1- ولتاموگرامهای چرخهای محلول -4/-3[6(CN)[Fe M 01/0 دارای NaCl M 1/0 در سطح (a) CPE و(b) /CPE 2SiO در سرعت روبش 1-s mV 5041
شکل 4-2- نمودار نایکویست مربوط به الکترود خمیر کربن برهنه (a) و الکترود خمیر کربن اصلاح شده با نانو ذرات 2SiO (b) در محلول M 01/0 از زوج اکسنده/کاهنده ]6(CN)[Fe4K/]6(CN)[Fe3 Kحاوی NaCl M 1/0 با سرعت روبش 1-s mV 10043
شکل 4-3- اکسایش برگشت ناپذیر تاموکسیفن سیترات44
شکل 4-4- نمودار شدت جریان دماغه اکسایش M 5-10 تاموکسیفن سیترات در سطح CPE/ 2SiO بر حسب pH محلول بافر فسفات M 1/0 45
عنوان صفحه
شکل 4-5- ولتاموگرامهای چرخهای الکترود خمیر کربن برهنه (a) و خمیر کربن اصلاح شده با نانو ذرات 2SiO (b) در محلول بافر فسفاتM 1/0 با 5/4 pH= دارایM 1/0 NaCl در سرعت روبش پتانسیل 1-s mV 50. (c) نظیر (a) و (d) نظیر (b) در حضور M 5-10 از تاموکسیفن سیترات46
شکل 4-6- الف) ولتاموگرامهای چرخهای محلول M 5-10 از تاموکسیفن سیترات در محلول بافر فسفات M 1/0 با 5/4PH= دارای M 1/0 NaCl در سرعتهای روبش پتانسیل مختلف: a) 25 ،b ) 50،c ) 100،d ) 150، e ) 200،f ) 300،g ) 400 میلی ولت بر ثانیه در سطح الکترود خمیر کربن اصلاح شده با نانو ذرات 2SiO . ب) تغییرات بر حسب سرعت روبش پتانسیل (نتایج از ولتاموگرامهای چرخهای (الف) بدست آمدهاند)47
شکل 4-7- الف) ولتاموگرامهای پالس تفاضلی تاموکسیفن با غلظتهای مختلف (a) 8-10 ×3 ، (b) 8-10 ×7 ،
(c) 7-10، (d) 7-10 ×3، (e) 7-10 ×5، (d) 7-10 ×7، (f) mol L-1 6-10 درمحلول بافر فسفات 5/4PH= واجدM NaCl 1/0 در سطح /CPE 2NSiO 1-s mV 100 = .υ ب) نمودار تغییرات جریان دماغه آندی بر حسب غلظت تاموکسیفن49
شکل4-8- نمودار شدت جریان دماغه اکسایش تاموکسیفن سیترات بر حسب غلظت تاموکسیفن50
شکل 5-1- تصویر نموداری از مراحل تهیه زیست حسگر الکتروشیمیایی i-motif DNA55
شکل 5-2- تصاویر SEM سطح (الف) CPE برهنه پس از پیشتیمار الکتروشیمیایی، (ب) CPE/Cys-2NSiO، (ج) CPE/2NSiO/ i-Motif DNAو (د) CPE/Cys-2NSiO/i-Motif DNA57
شکل5-3- ولتاموگرامهای چرخهای محلول-4/-3 [6(CN)[Fe M 01/0 دارای M NaCl 1/0 در بافر فسفات M1/0 با 5/4 pH= در سطح (a) CPE (b) CPE/2NSiO، (c) CPE/ 2 NSiO/ i-Motif DNA و (d) CPE/ Cys- 2 NSiO/i-Motif DNA در سرعت روبش 1-s mV 50 59
شکل5-4- ولتاموگرام چرخهای M 5-10 داروی تاموکسیفن در محلولM 1/0 بافر فسفات با 5/4 pH= دارای M 1/0 NaCl در سطحCPE (a) ، (b) CPE/ Cys- 2 NSiO، (c) CPE/Cys-2 NSiO/i-Motif DNA در سرعت روبش پتانسیل 1-s mV 5060
عنوان صفحه
شکل5-5- ولتاموگرام موج مربعی CPE/Cys- 2 NSiO/i-motif DNA، در حضور غظتهای فزایندهایی از تاموکسیفن:(a) 8-10×7، (b) 7-10، (c) 7-10×5، (d) 7-10×7، (e) 6-10، (f) 6-10 ×5، (g) 6-10 × 7، (h) M 5-10، در محلول بافر فسفات 5/4 pH= دارای M 1/0 NaCl . الف) ضمیمه ولتاموگرامهای موج مربعی:
(c , NSiO2-Cys/CPE (b ,CPE (a CPE/Cys-2 NSiO/i-motif DNA در غیاب تاموکسیفن. ب) نمودار تغییرات شدت جریان اکسایش تاموکسیفن بر حسب تغییرات غلظت آن……………………………………………………………………62
شکل5-6-الف) ولتاموگرام موج مربعی محلول تاموکسیفن با غلظت (a)M 4-10 و (b) M5-10 در بافر فسفات
5/4 pH= در سطح CPE/Cys- 2 NSiO/i-motif DNA، (c) نظیر (a) و (d) نظیر (b) در بافر فسفات
M1/0 با0/7 pH=63
شکل 5-6- ب) ولتاموگرام موج مربعی محلول تاموکسیفن با غلظت (a)M 4-10 و (b) M5-10 در محلول بافر فسفات M 1/0 با 5/4 pH= در سطح CPE/Cys- 2 NSiO/dsDNA، (c) نظیر (a) و (d) نظیر (b) در محلول بافر فسفات M 1/0 با0/7 pH= 64
شکل 5-7) طیف بینی CD محلول بافر فسفات M1/0 با a) 5/4 pH= و b) 0/7 pH= دارای µM i-motif DNA0/1…66
فهرست جدولها
عنوان صفحه
جدول3-1- موادشیمیایی مورد استفاده در این کار تحقیقاتی32
جدول4-1- نتایج حاصل از روش پیشنهادی در تعیین غلظت تاموکسیفن در نمونه پلاسما3 n=51

فهرست علائم و اختصارات
معادل فارسیمعادل انگلیسیعلائم و اختصاراتولتVoltVالکترود نقره/نقره کلرید/پتاسیم کلرید(M3)Silver/silverChloride/Potassium Chloride(3M)Ag/AgCl/KCl(3M)ثانیهSecondSمولارMolarMپتانسیلPotentialEمیکروآمپرMicroamperµAغلظتConcentrationCمیلی ولت بر ثانیهMilivolt per secondmV s-1سرعت روبش پتانسیلPotential sweep rateΥولتامتری چرخه ایCyclic voltammetryCVالکترود خمیر کربنCarbon paste electrodeCPEپتانسیل دماغهی آندیAnodic peak potentialEpaپتانسیل دماغهی کاتدیCathodic peak potentialEpcمیکروسکوپی الکترون روبشیScanning electron microscopySEMمیلی مولارMilimolarmMمیکروآمپرMicroamperµAمیکروگرمMicrogramμgنانومترNanometerNmحد تشخیصLimit of detectionLODانحراف استاندارد نسبیRelative standard deviationRSDآمپرAmpereA

1-1- مقدمه
تشخیصDNA ، یکی از حوزههای مهم بیولوژی مولکولی و مطالعات زیست فناوری است. تشخیص توالی بازهای خاص در نوکلئیک اسیدهای انسانی، ویروسی و باکتریایی از اهمیت بسزایی در حوزههای متعدد برخوردار است که دارای کاربرد در تشخیص: عوامل بیماری، ارگانیسمهای آلوده کننده غذایی، تحقیقات زیست محیطی و علوم جنایی میباشد. از زمانیکه پالیکیک1، فعالیت الکتروشیمیایی نوکلئیک اسیدها را کشف کرد [1]، زیست حسگرها امیدهای تازهای برای ایجاد روشهای سریع، ارزان و ساده برای تشخیص نوکلئیک اسیدها فراهم ساختهاند [2]. تشخیص یا آشکارسازی الکتروشیمیایی گونههای زیستی براساس واکنشهای الکتروشیمیایی است که در طول فرآیندهای تشخیص زیستی اتفاق میافتد [3] .به علت اینکه واکنشهای الکتروشیمیایی مستقیماً یک علامت الکترونیکی ایجاد میکنند، نیازی به دستگاههای گرانقیمت تبدیل علامت وجود ندارد. علاوه بر این، به علت اینکه کاوشگر2 میتواند براحتی بر روی الکترودها تثبیت شود، تشخیص آن میتواند توسط آنالیز الکتروشیمیایی ارزانقیمت انجام شود. همچنین سیستمهای قابل حمل برای آزمایشات کلینیکی و تحقیقات زیست محیطی توسعه یافته است [4]. ابزارهای الکتروشیمیایی، بسیار حساس، ساده و سریع بوده و براحتی به کار برده میشوند و با فناوریهای نانو سازگاری دارند. بنابراین به نظر میرسد، نامزدهای خوبی برای تشخیص سریع و ارزانقیمت بیماریهای ژنی و تشخیص گونههای بیولوژیکی پاتوژنی میباشند.
یکی از بزرگترین چالش‌ها در قلمرو الکتروشیمی تجزیهای، طراحی و ساخت الکترودهایی می‌باشد که در حالت ایده‌آل بتوانند به یک گونه‌ی شیمیایی خاص به صورت کاملاً گزینش‌پذیر و با حساسیت بالا پاسخ دهند. زیست حسگرهای3 الکتروشیمیایی، دسته وسیعی از الکترودهای اصلاح شده میباشند که امروزه بسیار مورد توجه محققین قرار گرفتهاند [5]. زیست حسگر، ابزاری است که از یک لایه فعال بیولوژیکی به عنوان جزء شناساگر استفاده میکند تا عوامل فیزیکی برهمکنش بیولوژیکی را به علامت قابل اندازهگیری تجزیهای تبدیل کند [6]. دو عامل در طراحی یک زیست حسگر مناسب نقش ایفا میکنند: الف) روش مناسب تثبیت پذیرنده زيستی در سطح مبدل که موجب افزایش طول عمر، حساسیت و پایداری آن میگردد. ب) انتخاب مبدل مناسب. انواع متداول مبدلهای مورد استفاده در زیست حسگرها، شامل مبدلهای: الکتروشیمیایی [8 ،7] ، نوری (نورتابی4، جذب و رزونانس پلاسمون سطح5 ) [9]، حساس به تغییر جرم [10] و حرارت می باشند [11]. زیست حسگرها خصوصیات و مزایای خوبی، نظیر: آسانی استفاده، سرعت تشخیص مناسب، حساسیت بالا و هزینه کمتر نسبت به روشهای طیف سنجی وکروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا را دارا میباشند که قادرند گونه آزمایشی مورد نظر را در غلظتهای بسیار کم در نمونه‌های بیولوژیکی اندازهگیری کنند [14-12]. در حقيقت زیست حسگرها، ميتوانند با بهرهگيري از هوشمندي مواد بيولوژيك، تركيب يا تركيباتي را شناسايي نمایند که با آنها واكنش داده و بدین ترتیب یک پيام شيميايي، نوري و يا الكتريكي تولید کنند. اساس کار یک زیست حسگر تبدیل پاسخ بیولوژیکی به یک پیام قابل اندازهگیری است [15]. بطور کلی هر زیست حسگر شامل، اجزای: گونه آزمایشی مورد نظر، لایه زیستی، مبدل، پردازشگر و نمایشگر است. انواع پذیرندههای زیستی که در زیست حسگرها مورد استفاده قرار میگیرند، شامل: آنزیم، آنتی بادی، گیرندههای سلولی، اسیدهای نوکلئیک DNA6 یا RNA7، میکروارگانیسم یا سلول کامل، بافت و غیره هستند [16].
یک زیست حسگر DNA، وسیلهای است که عامل تشخیص بیولوژیکی آن، کاوشگر DNA است. کاوشگرهای DNA، الیگونوکلئوتیدهای کوتاه تک رشتهای (ss-DNA) هستند که معمولاً کاوشگر نامیده میشوند. دئوکسی ریبونوکلئیک اسید (DNA)، یک مولکول رمزگذار دستورالعملهاي ژنتیکی است که در تمام موجودات زنده، شناخته شده میباشد. درشت مولکول8DNA ، یک ساختار مارپیچی شبیه نردبان دارد که گروههای فسفات و قند به طور یک در میان، نردههای نردبان و بازهای آدنین، گوانین، سیتوزین و تیمین پلههای آن را تشکیل میدهند که این بازها، دو به دو با یکدیگر توانایی تشکیل پیوند هیدروژنی قوی را دارند. DNA به خاطر حضورگروههای فسفات در ساختار آن، دارای بار منفی میباشد و از این رو خاصيت پلي آنيونی را دارد، به طوري كه بازهاي آلي به سمت داخل و گروه فسفات به سمت بيرون یا در سطح خارجي درشت مولکول DNAقرار میگیرند. در DNA، هر رشته از نوکلئوبازها تنها با یک نوع رشته دیگر از نوکلئوبازها جفت میشوند که به آن جفت شدن بازهای مکمل میگویند. در ساختار دو رشتهایDNA ، باز آدنین در مقابل تیمین با دو پیوند هیدروژنی و گوانین در مقابل سیتوزین با سه پیوند هیدروژنی قرار دارد. پس یک توالی خاص از DNA قادر است تنها به توالی مکمل خود پیوند شود [17]. در سالهای اخیر، تلاشهای زیادی برای طراحی زیست حسگرهای الکتروشیمیایی با صحت9، حساسیت10 و انتخاب پذیری11 تقویت شده، انجام شده است [18]. نانوذرات12 میتوانند در این زمینه بسیار مفید باشند و در طراحی زیست حسگرهای الکتروشیمیایی که نسبت به سایر زیست حسگرها کارائی بالاتری دارند، به طور عمده ای استفاده شوند [19].
نانوذرات به عنوان یکی از مهمترین ساختارها در حوزه فناوری نانو، با توجه به اندازه کوچک آنها، خواص فیزیکی، شیمیایی و الکترونیکی منحصر به فردی را نشان میدهند که در تهیه زیست حسگرها، بسیار مورد توجه میباشند [20]. ويژگيهاي يک ماده ميتواند به طور معني داري با اندازه ذرات آن تغيير کند. بسیاری از خواص ماده، از جمله: ويژگيهاي ساختاري، گرمايي، شيميايي، مکانيکي، مغناطيسي و نوري در اثر کاهش اندازه ذره تغییر ميکند. در نتیجه، با استفاده از این مواد در ساخت نانوزیست حسگرها، میتوان خواص جدید و مختلفی ایجاد نمود که از آنها، بتوان برای مطالعه بهتر سیستمهای متفاوت استفاده کرد. از میان نانوزیست حسگرها، نانوزیست حسگرهای الکتروشیمیایی رشد خوبی داشته است ]21 [.
نانوزیست فناوری DNA، فناوری بالقوهای است که از تلفیق زیست فناوری و فناوری نانو بوجود آمده است. نانوزیست فناوری DNA، از ساختار و خواص مولکول DNA جهت استفاده در زمینه زیستی، مهندسی و پزشکی بهره میبرد. هدف اساسی نانوزیست فناوری DNA، ساخت مواد با ساختار تکرار شونده، وسایل و ماشینهایی در ابعاد نانو، توسعهی این ساختارها به سطوح بزرگتر (ماکروسکوپی) با استفاده از خواص ساختاری و عملکردی و برهمکنشهای بین مولکولی DNA است. در این زمینه، یکی از مواردی که بسیار مورد توجه محققین قرار گرفته است، مطالعه و بررسی در مورد ساختار DNA و چگونگی عملکرد آن در شرایط محیطی متفاوت و برهمکنشهای آن با ترکیبات مختلف بوده است [22]. همانطور که میدانیم مولکول DNA یک ماده ژنتیکی است که حامل اطلاعات ژنتیکی در تمام موجودات زنده میباشد. مولکول DNA، دارای توالی خاصی ناشی از چگونگی آرایش بازهای تشکیلدهندهی آن میباشد که این توالی سبب ایجاد خواص خاصی در هر رشته DNA میگردد. توالی DNA جهت پردازش اطلاعات مفید بوده و سبب میگردد که ساختار آن به صورت پایا و محکم درآید. علاوه بر این، DNA دارای خواص منحصر به فردی مانند دارا بودن ساختار هندسی در ابعاد نانو13، ذخیره و کد کردن اطلاعات14، خودتکثیری15، خودتشخیصی ساختار16 و خودآرایی17 است [23]. امروزه، محققین تعداد زیادی از نانوزیست حسگر DNA ساختهاند که از آنها در جهت مطالعه برهمکنش DNA با سایر ترکیبات از جمله: داروها، پروتئینها و ترکیبات شیمیایی مختلفی استفاده شده است ]25،24[.
همچنین نانو مواد18 ، انتقال الکترون بین زیست مولکولهای تثبیت شده و سطح الکترود را آسان میکنند. نانوذرات برای تثبیت مولکولهای زیستی، کاتالیز واکنشهای الکتروشیمیایی، افزایش سرعت انتقال الکترون بین سطح الکترود و پروتئین، نشان دار کردن مولکولهای زیستی و حتی به عنوان واکنشگر عمل میکنند [26]. با توجه به بزرگی سطح مؤثر و بالا بودن سطح انرژی، نانوذرات بیومولکولها را بشدت جذب کرده و برای تثبیت مولکولهای زیستی در ساخت زیست حسگر بکار میروند [28 ،27]. انواع زیادی از نانوذرات، مانند: نانوذرات اکسیدی (مثلاً 2SiO) برای ساخت حسگرهای الکتروشیمیایی و زیست حسگرها به کار گرفته شدهاند [29]. این نانوذرات برای تثبیت مولکولهای زیستی به دلیل سازگاری خوب و آماده سازی آسان، استفاده شدهاند [31 ،30].
DNA تلومری انسان، از تکرارهای پشت سرهم بازهای تیمین، آدنین، گوانین و سیتوزین، CCCTAA)/(TTAGGG تشکیل شده است [32]. تلومرها دارای ساختار خاصی هستند که موجب استحکام و پایداری مولکول خطی DNA میشوند و انتهاي كرموزوم را از تجزيه شدن، نوآرايي و الحاق انتهايي حفظ ميكنند. در هر تقسيم سلولي به شكل پيوسته، بخشي از طول تلومر كوتاه میشود. كوتاه شدن پيوسته تلومر به جدا شدن يك سري از پروتئينها از ساختار تلومر و تغيير بيان ژن منجر ميشود. كوتاه شدن مداوم تلومر به توقف چرخه سلولي و مرگ سلولي ميانجامد [35-33]. تلومراز آنزيمي است كه بدون نياز به الگو، موجب سنتز تلومر میشود. اين سلولها به كمك آنزيم تلومراز، كوتاه شدن تلومر را كه در پي تقسيمهاي متوالي روي میدهد، جبران میکنند [36]. با این حال، آنزيم تلومراز، در حدود 90 درصد از سلولهاي سرطاني، سطح بالایی از فعالیت را دارد و همین فعالیت بالا منجر به ایجاد سرطان میگردد [38 ،37]. چنانچه اتصال تلومرازها به نواحی تلومری توسط برهمکنش مولکولهای کوچک با نواحی تلومری مهار شود، به شکل مستقیم فعالیت تلومراز کاهش مییابد.
از طرف دیگر، در رشتههای DNAی غنی از باز سیتوزین C، ساختارهایی می تواند شکل بگیرد که در آن، هر C از طریق پیوند هیدروژنی با سه C دیگر در ارتباط باشد، به شرط آنکه Cی مقابل آن به صورت همی پروتونه باشد، یعنی جفت باز C-C+ شکل بگیرد، به چنین ساختاری، ساختار i-motif میگویند و در شرایطی تشکیل میشود که رشته DNA غنی از باز سیتوزین باشد [40 ،39]. ترکیباتی که با توالیهای ذکر شده بر همکنش بدهند، قادر به مهارکردن فعالیت تلومراز میباشند. پایداری ساختارi-motif به تکرار توالی دارای سیتوزین، pH اسیدی ملایم، ماهیت و غلظت کاتیونهای موجود در محلول بستگی دارد. پایداری ساختار i-motif پیچ خورده در pH اسیدی ملایم، یک استراتژی خوب برای درمان سرطان است، چون می
تواند از واکنش تلومراز در سلول سرطانی جلوگیری میکند [41].
تاموكسيفن‌ يك‌ داروي‌ ضد سرطان‌ است‌ كه‌ براي‌ درمان‌ سرطان‌ پستان‌ تجويز مي‌شود. در مواردي‌ كه‌ سرطان‌ به‌ ساير نقاط‌ بدن‌ پخش‌ شده‌ باشد، نيز استفاده‌ مي‌شود. اين‌ دارو به‌ ويژه‌ بر روي‌ سرطانهايي‌ كه‌ با استرژون‌ تحريك‌ مي‌شوند، مؤثر مي‌باشد. استروژن رشد سلول‌های سرطانی پستان را بالا مي‌برد. بعضی از سرطان‌های پستان را در دستة گیرندة مثبت استروژن (حساس به هورمون) طبقهبندی مي‌كنند، بدین معنا که سلول‌های سرطانی پروتئینی دارند که استروژن به آن وابسته است. رشد این سلول‌های سرطانی به استروژن وابسته است. از آنجا كه تاموکسیفن برخلاف تأثیر استروژن بر این سلول‌ها عمل می‌کند، گاهی به آن ضد استروژن نیز میگویند. تاموکسیفن فقط در درمان گیرندة مثبت استروژن سرطان پستان مؤثر است. بنابراین، باید پيش از تصمیم‌گیری در مورد گزینه‌های درمانی، وضعیت گیرنده‌های هورمون تومور را جهت درمان سرطان پستان تعیین كرد. تاموکسیفن سیترات (غیر استروئیدی ضد استروژن) مهمترین عامل هورمونی در درمان سرطان سینه برای بیش از دو دهه شناخته شده که میتواند حدود 50 درصد زنانی که در خطر ابتلا به سرطان سینه هستند را درمان کند. این دارو با اتصال به گیرندههای سیتوپلاسمی (گیرنده
های استروژن)، تقسیم سلولی را مهار کرده و در فعالیت استروژن، که هورمونی زنانه است، مداخله میکند. استروژن احتمال پیشرفت سرطان را در پستان بالا میبرد. تاموکسیفن سیترات دارویی است که به صورت قرص خوراکی عرضه میشود [44-42].
در این کار، سعی میشود با طراحی زیست حسگرهایی بر مبنای ساختار i-motif، برهمکنش اين ساختار با داروی ضد سرطان تاموکسیفن سیترات19، مورد بررسی قرار گیرد. به دلیل اهمیت داروی تاموکسیفن سیترات در درمان سرطان سینه، چندین روش برای اندازهگیری این دارو ارائه شده که شامل الکتروفورز موئینه، کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا و طیف سنجی میباشد [45]، اما روشهای ذکر شده، پیچیده و پر هزینهاند. روشهای الکتروشیمیایی نسبت به روشهای دیگر، به دلیل: سادگی، حساسیت مطلوب، قابلیت انطباق با فناوریهای جدید، امکان کوچکسازی سیستم و هزینه پایین، بسیار مورد توجه قرار گرفتهاند [46].
با استفاده از طیف بینی دورنگ نمایی دورانی (CD)20، میتوان اطلاعاتی را در مورد ساختار تشکیل شده و حالت قرار گرفتن رشتههای DNA برای تشکیل ساختار i-motif بدست آورد. ویژگی ممتاز i-motif با طیف بینی دو رنگ نمایی دورانی تعیین میشود. معمولا” در طیف CD برای ساختار i-motif یک دماغه مثبت نزدیک 280 نانومتر و یک دماغه منفی در 260 نانومتر مشاهده میشود [47].
یک الکترود کار21 مناسب، نقش عمدهای در توسعهی زیست حسگر الکتروشیمیایی دارد. از میان الکترودهای کار مختلف، الکترودهای خمیر کربن (CPE)22 معمولترند زیرا خمیر کربن به راحتی و با هزینه کم تهیه می
شود و برای تهیه الکترودهای اصلاح شده با ترکیبات دیگر نیز بسیار مناسب هستند [48].
ازاینرو، در بخش اول این کار، یک زیست حسگر الکتروشیمیایی DNA با استفاده از الکترود خمیر کربن برهنه و خمیر کربن اصلاح شده با نانوذرات 2SiO تهیه شد. نانوذرات 2SiO میتواند سبب افزایش رسانایی سطح الکترود خمیرکربن شده و موجب بهبود علامت تجزیهاي الکترود اصلاح شده گردد. نانوذرات 2SiO، سبب افزایش حساسیت زیست حسگر DNA شده و دستیابی به حد تشخیصهای پایینتر نسبت به الکترود خمیر کربن برهنه را فراهم خواهد کرد. به دلیل اهمیت ساختار i-motif -DNAدر سلولهای بدن انسان و اهمیت زیاد این ساختار در بلوکه کردن انتهای تلومرها و مهار آنزیم تلومراز و همچنین بیماریهای ناشی از سرطانی شدن سلولها، مطالعه این نوع ساختارهای DNA و پایدار کردن آنها در اثر ایجاد پیوند با داروی تاموکسیفن به عنوان لیگاند مورد توجه قرار میگیرد. برای بررسی رفتار تاموکسیفن سیترات در پایدار کردن این ساختار، از فنون مختلف الکتروشیمیایی، نظیر: ولتامتری پالس تفاضلی، ولتامتری چرخهای استفاده شده و رفتار الکتروشیمیایی زیست حسگر تهیه شده قبل و بعد از مرحله تثبیت و برهمکنش با داروی مورد نظر بررسی میگردد. همچنین از روش طیف بینی دورنگ نمایی دورانی یا CD برای بدست آوردن اطلاعاتی در مورد نحوه برهمکنش این دارو با ساختار i-motif-DNA و نحوه شکلگیری ساختار مورد نظر استفاده میگردد. همچنین امکان اندازهگیری الکتروشیمیایی داروی تاموکسیفن سیترات در سطح الکترود خمیر کربن اصلاح نشده و اصلاح شده با ذرات 2SiO به کمک ولتامتری پالس تفاضلی و ولتامتری چرخهای مورد مطالعه قرار میگیرد.
2-1- الکترودهای اصلاح شده شیمیایی
اصلاح سطح الکترودها به منظور فراهم کردن برخی کنترلها روی چگونگی برهم کنش سطح الکترود با محیط پیرامون، یکی از پرکاربردترین بخش تحقیقاتی در الکتروشیمی طی چند دهه گذشته است [48]. ویژگیها و عملکرد مختلف این الکترودها عبارتند از: الکتروکاتالیز واکنشها [50 ،49]، آشکارسازی تغییرات در اثر انجام واکنشهای الکتروشیمیایی، جلوگیری از پدیدهی خوردگی، مفید برای توصیف فرایندهای انتقال الکترون و جرم در پلیمرها و دیگر مواد و آگاهی از اینکه چگونه واکنشها و فرایندها در ساختارهای سطحی اتفاق میافتد [51].
یک الکترود اصلاح شده شیمیایی بر اثر پوشاندن سنجیده سطح یک الکترود با لایه نازکی از یک ماده شیمیایی انتخابی به منظور تغییر و تعدیل برخی از ویژگیهای آن الکترود از قبیل خواص شیمیایی، نوری، الکترونیکی و انتقال بار بدست میآید [52]. هر الکترود اصلاح شدهی شیمیایی از دو قسمت بستر یا الکترود زمینه و اصلاحگر تشکیل میشود.
الکترود زمینهای که بهکار گرفته میشود خود باید چندین ویژگی منحصر به فردی داشته باشد تا برای مدتهای طولانی، بتوان از آن، استفاده کرد:
الف- باید هدایت الکتریکی بالایی داشته باشد.
ب- در برابر خوردگی و صدمات شیمیایی ناشی از محلول الکترولیت، مقاومت خوبی داشته باشد.
ج- در پتانسیلهای خیلی مثبت و تحت دماهای بالا و شرایط اسیدی شدید، برای زمانیکه الکترود به عنوان آند بهکار گرفته میشود، پایدار باشد.
د- همچنین از پایداری مکانیکی بالایی برخوردار باشد.
انواع الکترودهای زمینهای که بهکار گرفته میشوند، عبارتند از: مواد کربنی، شامل: خمیر کربن، گرافیت، کربن شیشهای، نانو لولههای کربنی و الکترودهای شبکه چاپی که بطور گستردهای در تحقیقات مبتنی بر نوکلئیک اسیدها و تشخیص الکتروشیمیایی آنها به علت مزایای متعدد این نوع الکترودها مورد استفاده قرار گرفتهاند [55-53]. همچنین، فلزات متعدد یا اکسیدهای فلزی، نظیر: طلا [56]، پلاتین [57]، نقره [58]، نیمرساناها در این زمینه نیز بکار رفتهاند.
لایههای اصلاحگر مورد استفاده برای اصلاح شیمیایی الکترودها میتواند از مواد مختلفی، از قبیل: سورفاکتانتها، گونههای معدنی جذب سطحی شده، نانوذرات فلزي يا شبه فلزي، نانو لولههاي كربني، ترکیبات آلی- فلزی و مواد بیولوژیکی تشکیل شده باشد [59]. اصلاح شیمیایی سطح الکترودها، یک مسیر قدرتمند برای تنظیم عملکرد آنها فراهم میکند. این اصلاح سطح، زمینههای تحقیقاتی جدیدی در الکتروشیمی تجزیهای باز میکند که موجب افزایش گزینش پذیری، پیش تغلیظ ترکیبات خاص، بهبود خواص الکتروکاتالیزی و یا کاهش تداخل در نمونههای پیچیده، مثل نمونههای زیستی میشود [60]. مساحت سطحی زیاد، عاملی کلیدی در کارکرد نانوذرات به عنوان کاتالیزوها در ساختارهای الکترودهای اصلاح شدهی شیمیایی میباشد [61]. به عنوان مثال، با استفاده از این خاصیت میتوان کارآیی کاتالیزورهای شیمیایی را به نحو مؤثری بهبود بخشید و یا در تولید چندسازهها23 با استفاده از این ذرات، پیوندهای شیمیایی مستحکمتری بین ماده زمینه و ذرات برقرار نموده و استحکام آنها را به شدت افزایش داد. علاوه براین، افزایش سطح ذرات، فشار سطحی را کاهش داده و منجر به تغییر فاصله بین ذرات یا فاصله بین اتمهای ذرات میشود. تغییر در فاصله بین اتمهای ذرات و نسبت سطح به حجم بالا در نانوذرات، تأثیر متقابلی در خواص ماده دارد. حسگرها و زيست حسگرها، نيز از انواع ديگر الكترودهاي اصلاح شده به روش شيميايي ميباشند كه به منظور اندازه گيري گونههای شیمیایی یا زیستی ارزشمند با كمترين تداخل، به صورت انتخابي در حضور ساير گونهها طراحي و ساخته ميشوند.
2-2- حسگرها
امروزه، نیاز روز افزون به تشخیص و اندازه‌گیری عناصر و ترکیبات شیمیایی در بخش‌های مختلف محیط اطراف، اعم از زنده یا غیر زنده، دیده می‌شود. این نیاز می‌تواند با مواردی چون جلوگیری از آلودگی محیط زیست، افزایش سلامتی و ایمنی فردی افزایش یابد. تشخیص و اندازهگیری مواد شيميايي موجود در جو و محيط زندگي، آلودگي آب‌ها، گازهاي قابل اشتعال در صنايع مختلف، كنترل سوخت‌ها، تعيين و تشخيص گونه‌هاي شيميايي در سيالات، محيط‌هاي زنده و به‌خصوص بدن انسان، نياز به كار بر روي حسگرها24 و زیست حسگرها25 را بيان مي‌كنند. در اين زمينه، مطالعه و تحقيق در مورد طول عمر حسگرها، پايداري فيزيكي و شيميايي و قابليت كاربرد آن‌ها در محيط‌هاي مختلف داراي اهميت خاصي مي‌باشد. تعیین آلایندههای محیطی و گونه‌های مورد نظر در مقادیر اندک، بدست آوردن حدود آشکارسازی پایین‌تر و بهبود در دقّت و صحت اندازه‌گیری‌ها از اهداف شیمی تجزیه نوین است. ساخت ابزاری که قابل حمل و کوچک بوده و دارای حساسیت بالا برای اندازه‌گیری گونههای شیمیایی مورد نظر باشد، از اهداف شیمیدانهای تجزیه است.
به‌ طور کلی حسگرها را می‌توان به عنوان ابزارهایی که یک کمیّت فیزیکی و یا شیمیایی مرتبط با گونه شیمیایی مورد نظر را به علایم قابل آشکارسازی تبدیل می‌کنند، تعریف کرد. حسگرها بسته به گونه شیمیایی مورد نظر، انواع متفاوتی دارند که از میان آن‌ها، حسگرهای الکتروشیمیایی و زیست حسگرهای الکتروشیمیایی دارای اهمّیت خاصی هستند [62].
2-3- حسگرهاي الکتروشیمیایی
حسگرهای الکتروشیمیایی، زیر شاخهی مهمی از حسگرهای شیمیایی میباشد که در آنها، الکترود به عنوان عنصر انتقال دهنده علائم، مورد استفاده قرار میگیرد [63]. حسگرهای الکتروشیمیایی در مقایسه با سایر حسگرهای شیمیایی به خاطر خواصی، نظیر سهولت آزمایش، قیمت کم و قابلیت شناسایی فوق العاده، بسیار مورد توجه هستند و در حوزههای کشاورزی، بالینی، زیست محیطی و صنعتی کاربرد وسیعی یافتهاند [64]. یک حسگر الکتروشیمیایی نوعی، شامل: یک الکترود حسگر26 (الکترود کار) و یک الکترود مخالف27 است که به‌وسیله لایه نازکی از الکترولیت از یکدیگر جدا شده‌اند (شکل 2-1). به ‌طور کلّی، حسگرهاي الکتروشیمیایی از طریق واکنش اکسایش-کاهش گونه مورد نظر روی سطح الکترود و تولید علامت الکتریکی متناسب با غلظت آن عمل می‌کنند. گونه مورد نظر، پس از آنکه از یک منفذ ورودی موئینه، داخل حسگر شد، از یک سد آب گریز28 عبور کرده و نهایتا به سطح الکترود می‌رسد. این امر باعث می‌شود که گونه مورد نظر در سطح الکترود کار، طی مکانیسم اکسایش-کاهش، وارد واکنش شده و یک علامت الکتریکی تولید کند که با غلظت گونه مورد نظر متناسب باشد. به ‌وسیله یک مقاومت خارجی که الکترودها را به هم متصل می‌کند، جریانی متناسب با غلظت گونه مورد نظر بین الکترودهای کار و مخالف جاری میشود. این جریان می‌تواند به منظور تعیین غلظت گونه آزمایشی مورد نظر مورد استفاده قرار گیرد. در حسگری که برای کار به یک ولتاژ خارجی نیاز دارد، داشتن پتانسیلی ثابت و پایدار در الکترود حسگر، از اهمیت زیادی برخوردار است. از نظر تاریخی، قدیمی‌ترین حسگر الکتروشیمیایی به دهه 1950 بر می‌گردد و به حسگرهاي گازی مربوط می‌شود که بر روی اندازه‌گیری‌های اکسیژن موجود در هوا استفاده می‌شدند [65]. پس از آن و در اواسط دهه 1980، حسگرهاي الکتروشیمیایی در ابعاد بسیار کوچک جهت شناسایی و اندازه‌گیری گازهای سمّی مختلف با حساسیت و گزینش‌پذیری بالا طراحی شدند [66].
حسگرهای الکتروشیمیایی را براساس نوع علامت تجزیهای ایجاد شده، به سه دسته اصلی: حسگرهای پتانسیل سنجی، آمپرسنجی و هدایت سنجی تقسیم میکنند [67]. در نهایت، علامت الکتریکی تولید شده در اثر انجام واکنش‌های اکسایش-کاهش روی سطح الکترود کار اندازهگیری میشود که متناسب با غلظت گونه مورد نظر است. میزان ولتاژ مورد نیاز جهت اعمال به الکترود کار هر حسگر آن را برای گونه آزمایشی مورد نظر گزینش‌پذیر می‌کند.
شکل 2-1- ساختار یک حسگر الکتروشیمیایی نوعی [68].
2-4- زيست حسگرها
حسگرهای الكتروشيمياييDNA ، توان تجزیهای روشهاي الكتروشيميايي را با خصوصيات فرآيند تشخيص اسيد نوكلئيك تلفیق کرده و اميدهاي زیادی را در تشخیص دورگه سازی DNA فراهم ساخته است. زیست حسگرها، ابزارهای تجزیهای هستند که میتوانند با بهرهگیری از هوشمندی مواد زیستی، پاسخ بیولوژیکی را به علامت و قابل اندازهگیری تبدیل کنند [69]. محصول این واکنش زیستی یک علامت نوری، الکتریکی یا شیمیایی است. گسترده ترین زمینه کاربرد این حسگرها در حوزه تشخیص طبی است. این لایه زیستی باید به نوعی مبدل متصل شود تا یک پاسخ قابل مشاهده را تولید کند. موادی که زیست حسگر به آن حساس است و به اندازهگیری آن میپردازد، سوبسترا29 و در واژه کلی تر، گونه آزمایشی مورد نظر نامیده میشوند [70].
زیست حسگر مناسب باید دارای شرایط و اهداف زیر باشد [71]:
• کاتالیزور زیستی باید هدف تجزیهای ویژه داشته باشد و تحت شرایط نرمال، پایدار بوده و تغییرات کمی را نشان دهد.
• واکنش نباید به پارامترهای فیزیکی از جمله هم زدن،pH و دما وابسته باشد.
• پاسخ در محدوده غلظتی مورد نظر، باید خطی، دقیق و صحیح باشد.
• برای اندازهگیری سریع نمونههای بیولوژیکی، لازم است که زیست حسگر، زمان تجزیه مناسبی داشته باشد
• یک زیست حسگرکامل، باید ارزان، کوچک، قابل حمل و توانمند باشد.
با این اهداف، زیست حسگرها با توجه به امکان برهمکنش ویژه با عنصر تشخیص مناسب (مولکول مورد نظر)، از گزینشپذیری بالایی برخوردارند [72]. عناصر تشخیص مناسب استفاده شده در زیست حسگرها، شامل: آنزیمها، نوكلئيك اسیدها، آنتی بادیها، و پذیرندهها هستند [73]. زیست حسگرها برای اهداف وسیعی، از جمله: اندازهگیری گونه‌های شیمیایی مورد نظر در مایعات بدن انسان و همچنین اندازهگیری در نمونههای محیطی به کار میروند [74].
2-5- زیست حسگر الکتروشیمیایی DNA
تشخیص DNA، یکی از حوزههای مهم زیست- مولکولی است که تشخیص توالی آن کاربرد زیادی در زمینه‌های مختلف بالینی، مواد غذایی و علوم جنایی دارد [75]. توسعه زیست حسگرها و ریز آرایههای DNA، در چند سال اخیر افزایش چشمگیری داشته است. گزارش‌های بسیاری از سامانه‌های شناسایی DNA بر پایه دو رگه شدن30 یک



قیمت: تومان

دسته بندی : پایان نامه

پاسخ دهید